یک میکروسکوپ انقلابی جدید ممکن است ماشین پنهان زندگی را آشکار کند

اکنون فیزیکدانان دانشگاه کالیفرنیا، برکلی، همین اصل را برای میکروسکوپ الکترونی آورده اند، فناوری که قادر است اجسام را تقریباً 10000 برابر بیشتر از میکروسکوپ های نوری معمولی بزرگ کند.

محققان دستگاهی به نام صفحه فاز لیزری ابداع کرده‌اند که می‌تواند میکروسکوپ کرایو الکترونی (cryo-EM) را تا حد زیادی بهبود بخشد. این روش تصویربرداری قدرتمند، مطالعه ساختارهای پروتئینی را متحول کرده و به تسریع کشف دارو در دهه گذشته کمک کرده است. با این حال، یک محدودیت عمده دارد: بیشتر پروتئین های انسانی آنقدر کوچک هستند که به دست آوردن تصاویر واضح از آنها بسیار دشوار است.

فناوری لیزری جدید می تواند به غلبه بر این مانع کمک کند و به طور بالقوه به دانشمندان اجازه می دهد تا پروتئین هایی را تصویربرداری کنند که به اندازه یک سوم پروتئین هایی هستند که میکروسکوپ های فعلی را به چالش می کشند.

تأثیر حتی بیشتر ممکن است از بهبود توموگرافی کرایو الکترونی (cryo-ET) حاصل شود. این رویکرد جدیدتر تصاویر گرفته شده از زوایای مختلف را برای ساختن نماهای سه بعدی از پروتئین ها و سایر مولکول ها ترکیب می کند. برخلاف تکنیک‌هایی که مولکول‌های جدا شده را در محلول مطالعه می‌کنند، cryo-ET می‌تواند نحوه چیدمان و تعامل پروتئین‌ها در محیط سلولی مادری خود را نشان دهد.

هولگر مولر، پروفسور فیزیک در دانشگاه کالیفرنیا برکلی و یکی از محققان آزمایشگاه ملی لارنس برکلی که پژوهشگر توسعه آزمایشگاه ملی لارنس برکلی است، می‌گوید: «کریو-EM به روش جدید و سریع‌الرشد برای حل ساختار ماکرومولکول‌های بیولوژیکی تبدیل شده است و انتظار می‌رود که کریو-ET نشان دهد که چگونه این مولکول‌ها در بافت طبیعی و سلولی خود با هم کار می‌کنند. “اما به دلیل محدودیت های سیگنال به نویز، اکثر پروتئین های انسانی و حیوانی برای تجزیه و تحلیل با این روش ها بسیار کوچک هستند. انتظار می رود افزایش نسبت سیگنال به نویز ارائه شده توسط این صفحه فاز لیزری بر این محدودیت های مهم غلبه کند.”

یک لیزر خارق العاده ساختارهای سلولی پنهان را آشکار می کند

این پیشرفت بر اساس چیزی است که محققان به عنوان شدیدترین لیزر موج پیوسته متمرکز جهان توصیف می کنند. به جای اینکه به سادگی یک نمونه را روشن کند، لیزر به طور مستقیم با پرتو الکترونی میکروسکوپ تعامل می کند و فاز آن را برای افزایش کنتراست تصویر تغییر می دهد.

این تنظیمات تشخیص مولکول های کوچک از جمله هموگلوبین را از محیطشان آسان تر می کند. همچنین می‌تواند دید ساختارهای داخل سلول‌ها مانند هسته و میتوکندری را افزایش دهد.

بریجت کاراگر، موسس CTO تصویربرداری در Biohub در شهر ردوود، کالیفرنیا، می‌گوید: «با کریو-ET، ما به دنبال مواد سلولی کوچک و بسیار پیچیده‌ای هستیم که به‌طور باورنکردنی در داخل سلول شلوغ است». “این مانند جنگلی از درختان است، و شما در حال تلاش برای یافتن یک برگ روی یک درخت در آنجا هستید. Cryo-ET به یک گام چشمگیر رو به جلو در مقابل نیاز دارد تا بتوانیم شروع کنیم به دیدن آنچه در داخل سلول می گذرد. ​​این چیزی است که صفحه فاز لیزری به ما وعده داده است.”

مولر با حمایت مالی Biohub، یک ابزار پیشرفته Cryo-EM را به دست آورد و آن را به صفحه فاز لیزری جدید مجهز کرد. او میکروسکوپ به دست آمده را Theia به نام تیتان یونان باستان نامید که با نور و درخشندگی مرتبط است.

در همین حال، کاراگر ساخت یک میکروسکوپ متصل را در مرکز تصویربرداری Biohub در شهر ردوود رهبری می‌کند. ابزار تیم او از دو لیزر به جای یک لیزر استفاده می کند که بر اساس تحقیقات نظری انجام شده توسط مولر و همکارانش است.

دو پرتو لیزر در زوایای قائم با یکدیگر قرار دارند و هر کدام تقریباً با نصف توان کار می کنند. این پیکربندی به جلوگیری از سوختن اجزا و کاهش اعوجاج نوری که می تواند کیفیت تصویر را به خطر بیندازد، کمک می کند.

هر دو تیم تحقیقاتی با Thermo Fisher Scientific، سازنده پیشرو ابزارهای کریو-EM کار می کنند.

مولر گفت: «تیا میکروسکوپ فرمول 1 است. این دستگاه دارای اپتیک های الکترونی اضافی است که وضوح بهتری نسبت به کرایو-EM استاندارد، حتی بدون لیزر به آن می دهد. با اضافه شدن صفحه فاز لیزر، ما امیدواریم که واقعاً به بهترین ابزار در جهان تبدیل شود.

آخرین تصاویر و یافته های فنی تیم برکلی در این مجله ارائه شده است علم. جزئیات طراحی لیزر دوگانه Biohub در یک پیش چاپ اخیراً منتشر شده در دسترس است.

چگونه یک کشف برنده جایزه نوبل میکروسکوپ را تغییر داد

برای درک اینکه چرا فناوری جدید اهمیت دارد، نگاه کردن به یک چالش طولانی مدت در تصویربرداری بیولوژیکی مفید است.

از آنجایی که سلول‌های گیاهی و حیوانی عمدتاً از آب تشکیل شده‌اند، وقتی زیر میکروسکوپ نوری معمولی مشاهده می‌شوند نسبتاً شفاف هستند. اگرچه این شفافیت ممکن است مفید به نظر برسد، اما مشکل ایجاد می کند. ساختارهای سلولی کوچک، از جمله میتوکندری و هسته، نور بسیار کمی را پراکنده می کنند و بنابراین فقط کمی تیره تر از مواد اطراف به نظر می رسند.

دانشمندان به طور سنتی با اضافه کردن لکه‌ها برای ایجاد کنتراست بیشتر با این مشکل مقابله می‌کنند. با این حال، رنگ آمیزی سلول ها را نیز از بین می برد.

در سال 1930، فیزیکدان هلندی، فریتز زرنیک متوجه شد که نوری که از مواد بیولوژیکی عبور می کند، به روش های بیشتری تغییر می کند تا فقط روشن تر یا کم نور شود. هنگامی که نور در داخل یک سلول پراکنده می شود، تاخیر کوچکی را نیز تجربه می کند، که فاز آن را تغییر می دهد یا زمان اوج موج آن.

اگرچه چشم انسان نمی تواند مستقیماً این تغییر فاز را تشخیص دهد، زرنیک کشف کرد که می توان آن را به تفاوت قابل مشاهده در روشنایی تبدیل کرد. او با تغییر فاز نور پراکنده نشده به میزان 90 درجه، هنگامی که نور به چشم بیننده می‌رسید، ویژگی‌های سلولی ظریف در پس‌زمینه‌شان به وضوح بیشتر نمایان شد.

این نوآوری پایه و اساس میکروسکوپ کنتراست فاز شد و زرنیک جایزه نوبل فیزیک 1953 را به ارمغان آورد.

در اوایل دهه 1940، دانشمندان قبلاً متوجه شده بودند که کنتراست فاز چقدر برای مطالعه سلول ها مفید است. آنها شروع به بررسی کردند که آیا همین ایده می تواند میکروسکوپ های الکترونی را که از الکترون ها به جای نور برای بررسی ساختارهایی به کوچکی پروتئین های منفرد استفاده می کنند، بهبود بخشد.

متأسفانه، تلاش های اولیه با مشکلات فنی جدی مواجه شد. دستگاه‌هایی که برای تغییر فاز پرتوهای الکترونی طراحی شده‌اند، اغلب پرتو را بیش از حد ضعیف می‌کنند، ناپایداری تصویر را ایجاد می‌کنند یا وضوح تصویر را کاهش می‌دهند.

یک راه حل ممکن در سال 2010 پدیدار شد، زمانی که مولر و رابرت گلسر، اکنون پروفسور ممتاز زیست شناسی مولکولی و سلولی در دانشگاه کالیفرنیا برکلی، استفاده از لیزر شدید را برای ایجاد تغییر فاز ضروری پیشنهاد کردند. رویکرد آنها راهی برای بهبود کنتراست بدون قربانی کردن شدت پرتو الکترونی ارائه می‌کند.

غلبه بر محدودیت های میکروسکوپ الکترونی

گلیزر در توسعه کرایو-EM نقش بسزایی داشت، که روش بالقوه ساده‌تری برای تعیین ساختارهای مولکولی نسبت به کریستالوگرافی اشعه ایکس سنتی ارائه می‌دهد.

کریستالوگرافی اشعه ایکس به محققان نیاز دارد تا بلورهای مولکول هایی را که می خواهند مطالعه کنند رشد دهند و به منبع پرتوهای ایکس شدید دسترسی پیدا کنند. Cryo-EM از نیاز به کریستالیزه کردن مولکول ها اجتناب می کند، اما مشکلات خود را ایجاد می کند.

یکی از بزرگترین مشکلات این است که پرتو الکترونی می تواند گرم شود و در نهایت به نمونه مورد مطالعه آسیب برساند. این مقدار اطلاعاتی را که می‌توان جمع‌آوری کرد و جزئیات تصاویر حاصل را محدود می‌کند. پوشاندن نمونه ها با فلز می تواند آسیب را کاهش دهد و کنتراست را بهبود بخشد، اما همچنین باعث می شود تصاویر وضوح کمتری داشته باشند.

در دهه 1960، محققان شروع به بررسی این موضوع کردند که آیا انجماد نمونه های بیولوژیکی می تواند آنها را از آسیب تشعشع محافظت کند.

گلیزر نشان داد که خنک کردن نمونه ها به حفظ آنها در طول تصویربرداری کمک می کند. او همچنین استفاده از یک پرتو الکترونی با شدت کمتر را برای کاوش همزمان هزاران مولکول یخ زده پیشنهاد کرد که آسیب را بیشتر محدود می کند.

از آنجایی که مولکول ها در زوایای مختلف قرار می گیرند، رایانه ها می توانند تصاویر خود را تجزیه و تحلیل و ترکیب کنند تا ساختار مولکولی بسیار دقیق را بازسازی کنند.

این دستاوردها به ایجاد پایه‌های Cryo-EM مدرن کمک کرد، که توسعه‌دهندگان آن جایزه نوبل شیمی 2017 را دریافت کردند. برندگان جایزه نوبل در طی اظهارات پذیرش خود، از کمک های گلاسر قدردانی کردند.

کمیته نوبل این فناوری را ستود و توضیح داد که cryo-EM “تصویربرداری از مولکول های زیستی را ساده و بهبود می بخشد. این روش بیوشیمی را به عصر جدیدی منتقل کرده است.”

15 سال تحقیق در مورد استفاده از لیزر بسیار قدرتمند

تبدیل مفهوم صفحه فاز لیزری به یک فناوری کار به سالها مهندسی نیاز داشت.

پس از پیشنهاد آنها در سال 2010، مولر 15 سال را صرف پیگیری این ایده کرد، با برخی تحقیقات که توسط مؤسسه ملی بهداشت حمایت شد.

اولین چالش بزرگ تولید یک پرتو لیزر بسیار شدید متمرکز در یک منطقه کوچک بود. محققان به شدت نور کافی برای تغییر فاز یک پرتو الکترونی 90 درجه نیاز داشتند.

توسعه سیستم لازم یک دهه طول کشید.

راه حل آنها این بود که یک پرتو لیزر پیوسته را در داخل یک محفظه کروی که با آینه پوشانده شده بود، محدود کنند. از آنجایی که نور به طور مکرر بیش از 10000 بار از طریق حفره منعکس می شود، شدت آن به طور چشمگیری افزایش می یابد تا زمانی که پرتو در یک نقطه بسیار کوچک متمرکز شود.

مولر گفت: «این 75 کیلووات است که روی چند میکرون متمرکز شده است. این لیزر قوی‌تر از آنچه برای جوشکاری استفاده می‌کنید، قوی‌تر از لیزر نظامی است. درخشان‌ترین فوکوس لیزر پیوسته را ایجاد می‌کند.»

این تیم ابتدا نشان داد که این مفهوم با نصب یک صفحه فاز لیزری در یکی از میکروسکوپ‌های الکترونی قدیمی‌تر گلیسر کار می‌کند.

بودجه اضافی از Biohub سپس امکان دستیابی به یک میکروسکوپ سفارشی و پیشرفته Thermo Fisher Krios Cryo-EM را فراهم کرد و آن را برای تطبیق با فناوری لیزر تغییر داد.

دانشمندان در جدیدترین مطالعه خود، میکروسکوپ بهبود یافته را با استفاده از شش نمونه مختلف که از نظر اندازه و روش آماده سازی متفاوت بودند، آزمایش کردند. لیزر به طور مداوم وضوح تصویر را بهبود می بخشد، با مزایای ویژه ای برای نمونه هایی که تصویربرداری با روش های استاندارد دشوار است.

مولر گفت: «برای چالش‌برانگیزترین موارد – ذرات کوچک، نمونه‌های بد – لیزر مزیت بسیار مهمی دارد.

تصاویر واضح تر از پروتئین هایی که زمانی برای مطالعه بسیار کوچک بودند

برای نشان دادن قابلیت‌های میکروسکوپ جدید، محققان تصاویر دو پروتئین مختلف را بازسازی کردند.

اولین مورد آلدولاز بود، پروتئینی که در عضله یافت می‌شود و سیستم‌های Cryo-EM مدرن اکنون می‌توانند نسبتاً آسان آن را تصویر کنند. دومی هموگلوبین بود، پروتئینی که وظیفه حمل اکسیژن از طریق خون را بر عهده دارد.

هموگلوبین بسیار کوچکتر است و در نزدیکی حد پایین اندازه پروتئین قرار دارد که ابزارهای معمولی کرایو-EM می توانند به طور قابل اعتماد آن را تجزیه و تحلیل کنند.

با استفاده از صفحه فاز لیزری، محققان وضوح دو ساختار پروتئینی را بهبود بخشیدند. این بهبود به ویژه در مورد هموگلوبین برجسته بود و پتانسیل این فناوری برای غلبه بر مشکلات مربوط به مولکول های کوچکتر را برجسته می کند.

مولر گفت: “نکته اصلی این است که اگر یک پروتئین بزرگ و یک نمونه واقعا خوب دارید – برای مثال، تازه یا منجمد بدون حباب – ممکن است برای گرفتن یک تصویر با کیفیت بالا نیازی به صفحه فاز نداشته باشید. اما برای یک پروتئین کوچک و یک نمونه بد، روشن کردن لیزر بهترین است.” این می تواند شکاف بزرگی را در دانش ما از ساختارهای پروتئینی که نمی توانند متبلور شوند یا برای کریو-EM امروزی بسیار کوچک هستند پر کند. و برای کریو-ET انقلابی خواهد بود.

توده پروتئین معمولاً بر حسب دالتون بیان می شود، واحدی که به نام جان دالتون شیمیدان انگلیسی نامگذاری شده است. یک دالتون به عنوان یک دوازدهم جرم اتم کربن 12 تعریف می شود.

کرایو-EM معمولی برای تصویربرداری از پروتئین های کوچکتر از تقریباً 70 کیلودالتون تلاش می کند. این حد اهمیت ویژه ای دارد زیرا پروتئین های زیر این آستانه حدود 90 درصد از پروتئوم انسان را نشان می دهند، مجموعه کاملی از پروتئین های تولید شده توسط بدن انسان.

با استفاده از صفحه فاز لیزر، محققان اکنون می توانند پروتئین هایی با وزن 50 کیلو دالتون را تصویربرداری کنند، اگرچه این یک چالش باقی مانده است. چنین پروتئین هایی حتی کوچکتر از هموگلوبین هستند.

هدف بعدی کشف پروتئین های کوچکتر است

مولر معتقد است که این فناوری می تواند در نهایت به دانشمندان اجازه دهد تا پروتئین هایی با وزن 17 کیلودالتون (اندازه پروتئین میوگلوبین) را مطالعه کنند.

دستیابی به این هدف ممکن است به بهبود دیگری نیاز داشته باشد: استفاده از یک پرتو الکترونی متمرکز به‌جای پرتوی بدون تمرکز که در حال حاضر برای به دست آوردن کنتراست کافی بدون صفحه فاز لیزر مورد نیاز است.

به گفته مولر، سیستم لیزر باید اجازه دهد که کنتراست مستقیماً از تغییرات فاز در یک پرتو الکترونی متمرکز به دست آید.

در صورت موفقیت آمیز بودن، این تنظیم می تواند کنتراست و نسبت سیگنال به نویز را مجدداً دو برابر کند و به بهبودی که قبلاً با صفحه فاز لیزر به دست آمده است اضافه کند.

چنین پیشرفت‌هایی می‌تواند مطالعه نسبت بسیار بیشتری از پروتئین‌های بدن را امکان‌پذیر کند و بینش بی‌سابقه‌ای درباره نحوه تعامل آنها در محیط پیچیده سلول‌ها ارائه دهد.

Stephanie Otte، معاون تصویربرداری Biohub می گوید: «این فناوری یک تغییر گام در عملکرد زیست شناسی است. “ما قادر خواهیم بود ببینیم که چگونه ماشین‌های مولکولی در داخل یک سلول زنده، در زمینه، برای اولین بار کار می‌کنند. آنچه زمانی نامرئی بود، قابل مشاهده خواهد شد – و این همه چیز را در مورد نحوه درک ما از بیماری تغییر می‌دهد.”

تیم تحقیقاتی برکلی همچنین شامل Glaeser است. پتار پتروف و جسی ژانگ، همکاران فوق دکترا و نویسندگان همکار. همکار پژوهشی جاناتان رمیس; همکار فوق دکتری هانگ چنگ; و دانشجویان فعلی و سابق فیزیک جرمی اکسلرود، اریک کوپر، ایان هیکلین، شاهار ساندهاوس و کوپر شنور.

در Biohub، کاراگر و دیوید آگارد، مدیر علمی موسس تصویربرداری، گروه زیست‌شناسی سلولی ساختاری پویا را رهبری می‌کنند. هر دو به همراه پاول اولشین، مهندس Biohub، پیش‌چاپ Biohub را نویسند.